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英国营养学杂志 ,交易量 104 ,问题 8 ，28 年 2010 月 1120 日，第 1128 - <> 页
DOI：https://doi.org/10.1017/S0007114510001819[在新窗口中打开]
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版权所有 © The Authors 2010
糖尿病与氧化应激和高血糖和高脂血症引起的炎症有关。高血糖和血脂异常会诱发自由基的产生、炎症反应和氧化应激反应，导致与肥胖和 2 型糖尿病相关的并发症和死亡。高血糖症由于线粒体中超氧阴离子的产生增加、蛋白质的非酶糖化和葡萄糖自氧化而引起氧化应激。在糖尿病患者高血糖和高脂血症引起的内源性抗氧化网络对葡萄糖和脂肪毒性缺乏适当的补偿反应的情况下，氧化应激变得明显，导致应激敏感的细胞内信号通路激活(参考资料 Poitout 和 Robertson1, 参考资料 Prentki， Joly 和 El-Assaad2).此外，高血糖会加速晚期糖基化终末产物 （AGE） 的形成，这些终末产物是由非酶糖化反应产生的蛋白质(参考资料 Ahmed3).AGE 诱导自由基形成，在正常衰老过程中积累，在糖尿病过程中加速积累，并与关节炎、动脉粥样硬化、肝硬化和糖尿病肾病等慢性疾病的发病机制有关(参考资料 Goh 和 Cooper4).特别是，AGE 积累与糖尿病肾病的存在和严重程度之间存在很强的相关性(参考资料 Monnier， Bautista 和 Kenny5).此外，2 型糖尿病患者几乎总是表现出脂质动力学的明显破坏，这通常反映在循环 NEFA 和 TAG 水平升高以及各种组织中过多的脂肪沉积上。因此，为了防止与结构和功能变化、氧化应激和/或炎症相关的糖尿病肾损伤，即使在血糖或血脂水平没有正常化的情况下，减少 AGE 的发展也很重要(参考资料 Coughlan， Cooper 和 Thomas6).
寡醇现已作为一种新的膳食成分在市场上销售，是一种由荔枝果实多酚衍生而来的优化酚类产品，含有儿茶素型单体和低分子量低聚物(参考资料 Fujii， Nishioka 和 Wakame7).根据最近的研究，越来越多的证据表明寡醇可以在体外和体内诱导一些生理和生化改变，例如诱导癌细胞凋亡(参考资料 Jo， Lee 和 Ahn8)、小鼠的抗氧化和抗炎作用(参考资料 Kundu， Chang 和 Fujii9)，以及对年轻运动员疲劳感的有益主观影响(参考资料 Ohno， Sakurai 和 Hisajima10).此外，口服寡酚可改善高脂肪饮食中小鼠白色脂肪组织中脂肪因子基因的调节(参考资料 Sakurai， Nishioka and Fujii11).事实上，据报道，含有低聚醇的原花青素的膳食喂养可诱导组织脂肪水平的显着衰减，与非原花青素喂养的动物相比，动物的总体质量没有改变(参考文献 Mittal， Elmets 和 Katiyar12).然而，没有证据支持寡酚是否对肥胖诱导的 2 型糖尿病的肾脂质代谢调节、AGE 诱导的氧化应激和肾脏炎症有任何影响。因此，我们研究了寡醇对高血糖诱导的肾损伤的影响，并检查了 db/db 小鼠肾脏中异常脂质合成和 AGE 形成。
材料和方法
寡醇
寡醇是由荔枝果实衍生的低聚多酚聚合物生成的。寡酚作为食品、膳食补充剂和药物添加剂的安全性已经得到证实(参考资料 Fujii， Nishioka 和 Wakame7).寡酚由 16·0% 单体（儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯）和 13·9% 二聚体（原花青素 A1、A2、B1 和 B2）的多酚混合物组成，而荔枝果多酚由 6·4% 单体和 9·8% 二聚体的混合物组成。Oligonol 是市售的（Amino Up Chemical Co.， Ltd，日本札幌）。
材料
蛋白酶抑制剂混合物溶液、4,6-二羟基-2-巯基嘧啶（2-硫代巴比妥酸）、EDTA、还原型谷胱甘肽 （GSH） 和氧化型谷胱甘肽 （GSSG） 购自 Wako Pure Chemical Industries， Ltd（日本大阪）。2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯购自 Molecular Probes（美国俄勒冈州尤金）。Bio-Rad 蛋白质检测试剂盒和纯硝酸纤维素膜购自 Bio-Rad Laboratories（日本东京）。β-肌动蛋白、邻苯二甲醛、苯甲基磺酰氟和 N-乙基马来酰亚胺购自 Sigma Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）。针对 NF-κBp65、甾醇调节元件结合蛋白 （SREBP）-1、SREBP-2、PPARα 和 AGE 受体 （RAGE） 的兔多克隆抗体，以及针对环加氧酶-2 （COX-2） 和诱导型 NO 合酶 （iNOS） 的小鼠单克隆抗体购自 Santa Cruz Biotechnology， Inc.（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。单克隆抗 N 抗体 ɛ-（羧乙基）赖氨酸 （CEL） 抗体和多克隆抗 N 抗体 ɛ-（羧甲基）赖氨酸 （CML） 抗体由 R. Nagai 博士（日本熊本大学）友情提供。山羊抗兔和山羊抗小鼠 IgG 辣根过氧化物酶偶联的二抗购自 Santa Cruz Biotechnology， Inc.（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。ECL Western Blotting Detection 试剂购自 Amersham Bioscience（美国新泽西州皮斯卡塔韦）。
实验动物和治疗
本研究遵循富山大学批准的“动物实验指南”（注册号 S-2006 INM-22）。雄性 C57BLKS/J db/db 和 m/m（朦胧，非糖尿病）小鼠，5 周龄，购自日本 SLC Inc.（日本滨松），并饲养可免费获得实验室颗粒食物（CLEA Japan Inc.，日本东京），包括 60·5% 碳水化合物、24·0% 蛋白质和 3·5% 脂质和水。它们被维持在受控环境（22 ± 2°C，50 ± 5 % 湿度，12 小时光照–12 小时黑暗循环）中。适应后，测量尾静脉取血和体重的葡萄糖水平，然后将 db/db 小鼠分为 10 组。db/db 载体组 （n 10） 口服水，而其他两组 （每组 n 10） 每天以 20 或 6 mg/kg 体重的剂量口服寡醇。将非糖尿病 m/m 小鼠 （n 8） 作为正常组与糖尿病组进行比较。在实验期间每天测定食物和水的摄入量。给药 2 周后，通过麻醉小鼠的心脏穿刺收集血样。离心后立即分离血清。随后，用冰冷的生理盐水灌注每只小鼠，然后收获肾脏，在液体 N80 中快速冷冻并储存在 − <>°C 直至分析。
血清样品的测定
使用商业试剂盒（分别来自日本大阪 WAKO Pure Chemical Industries， Ltd. 的葡萄糖 CII 检测、甘油三酯 E 检测、胆固醇 E 检测和 NEFA C 检测）测量血清葡萄糖、TAG、总胆固醇和 NEFA。为了测定血清尿素 N 和肌酐，BUN Kainos 和 CRE-EN Kainos 从 Kainos Laboratory Inc.（日本东京）获得。基于 ELISA 测量血清胰岛素和瘦素（森永生物科学研究所，日本横滨）、脂联素（CycLex Co.， Ltd，日本长野）和己酰赖氨酸（衰老控制研究所，日本静冈）水平。使用 Ali 等人的方法测定血清活性氧 （ROS） 水平。 (参考 Ali、LeBel 和 Bondy13)，并且采用Naito和Yamanaka的方法检查了2-硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）水平。(参考资料 Naito 和 Yamanaka14).
测定肾脏中的葡萄糖、TAG 和总胆固醇含量
为了测量肾脏中的葡萄糖浓度，用 0·9% NaCl 匀浆组织，加入 0·15 M-BA（OH）2 和 5 % ZnSO4，然后在 1400°C 下以 15 g 离心 4 分钟(参考资料 Momose， Yano 和 Ohashi15).使用 Wako 试剂盒 （葡萄糖 CII-Test） 评估上清液组分的葡萄糖浓度。根据 Folch 等人的方法，用氯仿和甲醇的混合物 （2：1， v/v） 提取总脂质。 (参考文献 Folch， Lees and Sloane Stanley16)，如上所述，使用 Wako 试剂盒测量 TAG 和总胆固醇水平。
肾脏中活性氧和 2-硫代巴比妥酸反应物质水平的测定
采用 Ali 等人的方法测量 ROS 的产生。 (参考 Ali、LeBel 和 Bondy13).将肾组织在冰上用 1 m m-EDTA-50 mM-磷酸钠缓冲液 （pH 7·4） 匀浆。简而言之，将 25 mM-2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯加入匀浆中，并在 30 分钟后，在 486 nm 的激发波长和 530 nm 的发射波长下测定荧光的变化。TBARS水平是根据Mihara和Uchiyama的方法估计的(参考资料 Mihara 和 Uchiyama17).
测定肾脏中还原和氧化的谷胱甘肽水平
GSH和GSSG的分析是使用Hissin和Hilf的方法进行的。(参考资料 Hissin 和 Hilf18).将肾组织用 1 mM-EDTA–100 mM-磷酸钠缓冲液 （pH 8·0） 在冰上匀浆。然后，加入 25% 间位磷酸沉淀蛋白质。将匀浆在 4°C 下以 100 000 g 离心 30 分钟。上清液组分用于 GSH 和 GSSG 的测定。为了测定 GSH，先用缓冲液稀释上清液组分，然后用邻苯二甲醛稀释。为了测定 GSSG 浓度，与 N-乙基马来酰亚胺预孵育 20 分钟后，使用 0·1 m-NaOH 代替磷酸钠缓冲液 （pH 8·0）。在室温下 15 分钟后，估计激发波长为 360 nm 和发射波长为 460 nm 的荧光。根据Itzhaki和Gill的方法测量蛋白质浓度(参考资料 Itzhaki 和 Gill19)使用牛血清白蛋白作为标准品。
核级分和核后组分的制备
为了制备细胞核组分，用含有 5 mM-2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇 （Tris）-HCl （pH 7·5）、2 mM-MGCL 2、15 mM-CACL 2 和 1·5 M-蔗糖的冰冷裂解缓冲液匀浆肾脏，然后加入 0·1 M-二硫苏糖醇 （DTT） 和蛋白酶抑制剂混合物。样品在 10°C 下以 500 20 g 离心 4 分钟后，用核提取缓冲液（20 mM-2[4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸 （pH 7·9）、1·5 m m-MgCl2、0·42 M-NACL、0·2 mM-EDTA、25 % （v/v） 甘油、0·1 M 悬浮沉淀-DTT 和蛋白酶抑制剂混合物）。将混合物置于冰上 30 分钟后，在 20°C 下以 500 5 g 离心 4 分钟制备细胞核组分。 核后部分从每只小鼠的肾脏中提取，如下所述。简而言之，用含有 7 m m-NaCl、4 mM-137-氨基-20-羟甲基-丙烷-2,2-二醇 （Tris）-HCl、1% 吐温 3、1 % 甘油、20 m间苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物的冰冷裂解缓冲液 （pH 10·1） 匀浆肾组织。然后将匀浆在 2000°C 下以 10 g 离心 4 分钟。 使用 Bio-Rad 蛋白试剂盒以牛血清白蛋白为标准品测定每个组分的蛋白质浓度。
蛋白质印迹分析
在 40–2% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳 RAGE、CEL、CML、COX-40 和 iNOS 表达的核后蛋白 （1 μg） 和 PPARα、SREBP-2、SREBP-65 和 NF-κBp8 的核蛋白 （10 μg）。将分离的蛋白质转移到纯硝酸纤维素膜上，用 5% 脱脂牛奶溶液封闭 1 小时，然后与一抗在 4°C 下孵育过夜。 洗涤膜后，在室温下与山羊抗兔或山羊抗小鼠 IgG 辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育 1 小时。使用 ECL Western Blotting 检测试剂对每种抗原-抗体复合物进行可视化，并使用 LAS-4000（Fujifilm，Tokyo，Japan）进行化学发光检测。通过使用图像分析仪 ATTO 密度仪 （ATTO， Tokyo， Japan） 计算条带密度，并归一化为 β-肌动蛋白。蛋白表达水平相对于 m/m 小鼠的表达水平表示（表示为 1）。
统计分析
所有结果均表示为带有标准误差的平均值，并使用单因素方差分析进行统计分析，然后对组间个体差异进行 Dunnett 检验。P < 0·05 的值被认为是显著的。
结果
食物和水的摄入量以及体重增加
db/db 小鼠 8 周后的食物和水摄入量以及体重增加显著高于年龄匹配的 m/m 小鼠。db/db 小鼠组的食物和水摄入量或体重增加没有变化（数据未显示）。
血液学分析
表 1 显示了血清成分（葡萄糖、TAG、总胆固醇和 NEFA）、葡萄糖和脂质代谢相关激素（胰岛素、瘦素和脂联素）、肾功能参数（尿素 N 和肌酐）和与氧化应激相关的生物标志物（ROS、己酰赖氨酸和 TBARS）。除血清脂联素外，与 m/m 小鼠相比，db/db 载体中的所有血清成分和生物标志物均升高。寡醇治疗没有改变血清葡萄糖和瘦素浓度;然而，它显着增加了胰岛素水平。以 20 mg/kg 的寡醇给药的 db/db 小鼠显示 TAG 、 总胆固醇 、 NEFA、 ROS 、己酰赖氨酸、 TBARS 、尿素 N 和肌酐水平显着降低。db/db 载体中的血清脂联素水平显着低于 m/m 小鼠，而寡酚给药提高了其降低的浓度。此外，与 m/m 小鼠相比，db/db 载体中尿素 N 和肌酐水平显着升高。然而，用 20 mg/kg 的寡醇处理后，这些增加的水平显着降低。
表 1血液学分析
（平均值及其标准误差）
m/m，非糖尿病迷雾小鼠;载体，db/db 载体处理的小鼠;oligo-10，db/db 小鼠用 10 mg/kg 体重的寡醇处理;Oligo-20，db/db 小鼠用 20 mg/kg 体重的寡醇处理;ROS，活性氧;TBARS，硫代巴比妥酸反应物质;MDA，丙二醛。
平均值与车辆组的平均值显著不同： * P < 0·05， ** P < 0·01， *** P < 0·001。
与肾脏氧化应激相关的生物标志物
在 db/db 载体小鼠中，与 m/m 小鼠相比，肾脏中的 ROS 浓度显着增加，但 10 或 20 mg 寡酚处理将这种增加分别降低到 36% 或 75%（表 2）。此外，与 m/m 小鼠相比，肾 TBARS 水平增加了 1·36 倍 （m/m， 1·11;db/db 小鼠，1·51 nmol/mg 蛋白;P < 0·01）。然而，在寡醇处理的 db/db 小鼠组中，升高的肾 TBARS 水平显著降低，并且通过用 20 mg/kg 的寡醇处理，肾 TBARS 水平降低到接近 m/m 小鼠的水平。关于 GSH：GSSG 比率，db/db 载体组与 m/m 组相比表现出显着降低，这是由于肾脏中 GSSG 浓度的显着增加。然而，寡醇治疗并没有显着改变肾脏 GSH 水平和 GSH：GSSG 比率（表 2）。
表 2与肾脏氧化应激相关的生物标志物
（平均值及其标准误差）
m/m，非糖尿病迷雾小鼠;载体，db/db 载体处理的小鼠;oligo-10，db/db 小鼠用 10 mg/kg 体重的寡醇处理;Oligo-20，db/db 小鼠用 20 mg/kg 体重的寡醇处理;ROS，活性氧;TBARS，硫代巴比妥酸反应物质;MDA，丙二醛;GSH，还原型谷胱甘肽;GSSG，氧化谷胱甘肽。
平均值与车辆组的平均值显著不同： * P < 0·05， ** P < 0·01， *** P < 0·001。
肾脏重量和肾葡萄糖、TAG 和总胆固醇水平
三组 db/db 小鼠的肾脏重量大于 m/m 小鼠（表 3）。db/db 载体小鼠肾脏中的葡萄糖水平与 m/m 小鼠相比增加 2·58 倍以上。此外，与 m/m 小鼠相比，db/db 载体小鼠的 TAG 含量增加了 1·49 倍，肾脏胆固醇含量增加了 1·56 倍。然而，肾 TAG 和胆固醇水平的这些增加在给予 10 或 20 mg 寡醇后显着降低，如 表 3 所示。
表 3肾重和肾葡萄糖、TAG 和总胆固醇含量
（平均值及其标准误差）
m/m，非糖尿病迷雾小鼠;载体，db/db 载体处理的小鼠;oligo-10，db/db 小鼠用 10 mg/kg 体重的寡醇处理;用 20 mg/kg 体重的寡酚处理的 oligo-20，db/db 小鼠。
平均值与车辆组的平均值显著不同： * P < 0·05， ** P < 0·01， *** P < 0·001。
与肾脏脂质代谢相关的蛋白质表达
与 m/m 小鼠相比，db/db 载体中的肾脏 PPARα 蛋白表达降低;然而，用 20 mg/kg 寡酚处理的组显示 PPARα 蛋白表达上调（图 1）。db/db 小鼠肾 SREBP-1 和 SREBP-2 蛋白表达分别显著高于 m/m 小鼠。然而，与 db/db 载体小鼠相比，施用 20 mg/kg 寡醇的 db/db 小鼠的 SREBP-1 蛋白表达显著降低，但 SREBP-2 的蛋白表达没有降低（图 1）。
图 1PPARα （a）、甾醇调节元件结合蛋白 （SREBP）-1 （b） 和 SREBP-2 （c） 在肾组织中的表达。m/m， 非糖尿病迷雾小鼠;Veh，db/db 载体处理的小鼠;oligo-10，db/db 小鼠用 10 mg/kg 体重的寡醇处理;用 20 mg/kg 体重的寡酚处理的 oligo-20，db/db 小鼠。值是平均值，标准误差由竖线表示。平均值与车辆组的平均值显著不同： * P < 0·05，** P < 0·01。
晚期糖基化终末产物受体的蛋白表达，Nɛ-（羧乙基）赖氨酸和 Nɛ-肾脏中的（羧甲基）赖氨酸
为了评估肾脏中的 RAGE 、 CEL 和 CML 蛋白表达，我们进行了 Western blot 分析。如图 2 所示，与 m/m 小鼠相比，db/db 载体中的肾 RAGE、CEL 和 CML 升高（分别为 2·34、2·69 和 4·36 倍）。然而，寡酚处理组显示这些 AGE 及其受体的显着下调。
图 2晚期糖基化终末产物受体 （RAGE） （a）， N ɛ-（羧乙基）赖氨酸 （CEL） （b） 和 N ɛ-（羧甲基）赖氨酸 （CML） （c） 在肾组织中的表达。m/m， 非糖尿病迷雾小鼠;Veh，db/db 载体处理的小鼠;oligo-10，db/db 小鼠用 10 mg/kg 体重的寡醇处理;用 20 mg/kg 体重的寡酚处理的 oligo-20，db/db 小鼠。值是平均值，标准误差由竖线表示。平均值与车辆组的平均值显著不同： * P < 0·05，** P < 0·01。
炎症蛋白在肾脏中的表达
在 db/db 载体组中，与 m/m 组相比，NF-κBp65、COX-2 和 iNOS 蛋白表达显著上调（图 3）。这些与肾脏炎症和 ROS 生成相关的蛋白质表达的增加通过寡醇的给药而显着降低，这意味着 NF-κB 的失活和与 COX-2 和 iNOS 相关的 NF-κB 的下调。
图 3NF-κBp65 （a）、环加氧酶-2 （COX-2） （b） 和诱导型 NO 合酶 （iNOS） （c） 在肾组织中的表达。m/m， 非糖尿病迷雾小鼠;Veh，db/db 载体处理的小鼠;oligo-10，db/db 小鼠用 10 mg/kg 体重的寡醇处理;用 20 mg/kg 体重的寡酚处理的 oligo-20，db/db 小鼠。值是平均值，标准误差由竖线表示。平均值与车辆组的平均值显著不同： * P < 0·05，** P < 0·01。
讨论
寡酚是一种从荔枝果实提取物中提取的酚类产品，含有儿茶素型单体和原花青素的低聚物，通过将多酚聚合物转化为低聚物的制造工艺生产(参考资料 Tanaka， Yoshitake and Zhao20).寡酚是通过多酚聚合物（通常是原花青素）的低聚化产生的;因此，与通常含有高分子量原花青素的水果和植物来源相比，寡聚醇提供更高水平的低聚原花青素。寡醇反映了荔枝果实的酚类成分，包括儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯的单体，以及原花青素 A1、原花青素 A2、原花青素 B1 和原花青素 B2 的低聚物(参考文献 Sarni-Manchado， Le Roux 和 Le Guernevé21).据报道，这些原花青素在许多研究中表现出有益的生物活性，因此寡酚是多酚的丰富来源，预计对各种慢性疾病有良好的效果。当然，已经报道了寡醇对抗氧化剂、抗癌、抗衰老和抗炎的许多有益生理活性，而在 2 型糖尿病中，寡醇对肾脏的影响尚未确定。因此，我们研究了寡酚对 C57BLKS/J db/db 小鼠肾脂质代谢、氧化应激、AGE 形成和炎症的保护作用。
在本研究中，检查了寡醇对血清参数（如葡萄糖和血脂水平）及其相关激素的影响。我们发现 db/db 小鼠表现出高血糖和高脂血症。寡酚的给药通过降低 TAG、总胆固醇和 NEFA 来降低高脂血症。然而，尽管血清胰岛素升高，但寡醇治疗并不影响血糖浓度（表 1）。在寡酚给药的 db/db 小鼠中，胰岛素分泌增加的原因尚不清楚，可能与寡酚处理保持胰腺β细胞功能有关。在 Kanda 等人的研究中，db/db 小鼠表现出胰腺 β 细胞凋亡，在 8 周龄时很容易检测到，并且在 12 周龄时细胞增殖减少，胰岛中胰岛素含量降低(参考资料 Kanda， Shimoda 和 Tawaramoto22).此外，寡醇处理的血清脂联素浓度显着高于载体 db/db 组。脂联素水平低与 2 型糖尿病患者和实验动物的胰岛素抵抗有关(参考文献 Rabe， Lehrke and Parhofer23).不幸的是，我们无法测量胰岛素对目标组织（如肌肉和脂肪）的影响。然而，除了血糖和胰岛素水平外，通过寡醇给药，其他生物因素（如血脂和氧化应激）在 2 型糖尿病情况下是有利的，尤其是肾脏损伤。此外，为了研究寡酚对高血糖和异常脂质合成诱导的肾损伤的影响，还检查了 db/db 小鼠肾脏中的高血糖和高脂血症水平。施用寡醇后，TAG 的肾脏内容物和总胆固醇显着降低（表 3）。这些结果表明，db/db 小鼠血清中寡醇的生物活性与脂质代谢有关，例如合成或沉积以产生能量。
高血糖和 NEFA 水平升高导致 ROS 的产生，从而增加氧化应激。ROS 不仅通过氧化 DNA、蛋白质和脂质直接损伤细胞，还通过激活多种应激敏感的细胞内信号通路间接损伤细胞，如 NF-κB、p38 丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK）、NH2 末端 Jun 激酶/应激活化蛋白激酶、己糖胺、蛋白激酶 C、AGE/RAGE 等。这些通路的激活导致许多基因产物的表达增加，这些基因产物会导致细胞损伤，并在糖尿病晚期并发症的病因中起主要作用(参考资料 Evans， Goldfine 和 Maddux24).因此，内源性抗氧化系统的上调和氧化应激的抑制是改善糖尿病及其并发症的重要因素。在本研究中，我们研究了 ROS 生成和脂质过氧化，作为与氧化应激相关的生物标志物，还测量了 GSH 和 GSSG 作为内源性抗氧化系统的指标。脂质过氧化还导致许多分子产生氧化剂，从而放大氧化损伤(参考资料 Niki， Yamamoto 和 Komuro25).目前的结果表明，db/db 小鼠血清和肾脏中 ROS 生成水平和脂质过氧化水平增加，这意味着由于高血糖和高脂血症诱导的 ROS 生成升高，这些小鼠表现出增加的氧化损伤。然而，寡酚处理发挥抗氧化活性，促进血清 ROS 和 TBARS 水平降低，对 db/db 小鼠的肾组织产生相应影响 （表 2）。这表明寡醇的给药将通过抑制 ROS 生成和脂质过氧化来改善 2 型糖尿病的氧化应激，因此，它会导致氧化应激引起的肾脏疾病的改善。
脂质稳态受称为 SREBP 的膜结合转录因子家族的调节。据报道，在瘦素抵抗小鼠（如 ob/ob 和 FVB）中 SREBP-1 和 SREBP-2 的上调分贝/分贝小 鼠(参考资料 Tobe， Suzuki 和 Aoyama26, 参考资料 Wang， 江 and Li27).在本研究中，oligonol 的给药下调了 db/db 小鼠肾脏 SREBP-1 和 SREBP-2 的增加。这可能与抑制肾脏 TAG 和总胆固醇积累有关。此外，具有三种亚型 （α、δ 和 γ） 的 PPAR 也参与脂质代谢的长期调节，其活性受内源性脂质衍生配体的调节。当 PPARα 被激活时，它会促进脂肪酸氧化、酮体合成和葡萄糖保留(参考 Ferré28)并改善 DB/DB 小鼠的糖尿病、胰岛素抵抗、白蛋白尿、肾小球肥大和系膜扩张(参考资料 Park， Zhang 和 Zhang29).在本研究中，寡酚给药后 db/db 小鼠肾 PPARα 水平降低显着增加。这些结果阐明了寡酚对 PPARα 和 SREBP 调节的影响。
AGE 是通过还原糖和蛋白质、脂质或核酸上的胺残基之间的非酶反应形成的复杂化合物(参考资料 Goh 和 Cooper4).AGE 的细胞内产生和积累与糖尿病并发症（如神经病变、视网膜病变和肾病）密切相关(参考资料 Ahmed3, 参考资料 Baynes 和 Thorpe30).特别是，AGE 积累与糖尿病肾病的持续时间和严重程度之间存在很强的相关性(参考资料 Monnier， Bautista 和 Kenny5).AGE 可以与某些受体（如 RAGE）相互作用以诱导细胞内信号传导，从而导致氧化应激增强和关键促炎和硬化细胞因子的产生。最近，人们关注 AGE 的重要作用，即 AGE 改变基质组织蛋白的结构和功能，AGE 修饰的蛋白通过特定的细胞表面受体刺激多种细胞反应，导致致病介质的表达和激活，例如，细胞外基质、氧化应激、细胞因子和生长因子与糖尿病肾病的发展和刺激有关(参考资料 Yan， Schmidt 和 Anderson31).在本研究中，我们对肾组织进行了蛋白质印迹分析，评估了与细胞内反应相关的受体的 AGE 作用，以及在衰老和糖尿病相关疾病中发现的物理化学表征的肾脏 AGE 水平，例如 CEL 和 CML。这些产品不仅来源于葡萄糖代谢的中间体和糖酵解的代谢物，而且还作为碳水化合物和脂质氧化反应产生的氧化应激的一般生物标志物(参考资料 Koito， Araki 和 Horiuchi32).CML 的形成也是通过乙二醛发生的，乙二醛是通过葡萄糖的自氧化产生的(参考资料 Wells-Knecht， Zyzak 和 Litchfield33)、 席夫碱的氧化裂解(参考文献 Glomb 和 Monnier34)和不饱和脂肪酸(参考文献 Fu， Requena 和 Jenkins35).氧化应激状态增强可能导致 CML 形成，尽管 CML 通常被视为一种糖氧化产物。CML 也可以通过脂质过氧化和通过髓过氧化物酶途径生成乙醛形成(参考文献 Fu， Requena 和 Jenkins35).事实上，没有氧化应激就无法形成 CML(参考资料 Baynes 和 Thorpe30).因此，CML 可以作为碳水化合物和脂质氧化反应引起的氧化应激的一般生物标志物。此外，最近的研究表明，甲基乙二醛是通过 Embden-Meyerhof 和多元醇途径产生的，并迅速与蛋白质反应形成甲基乙二醛衍生的 AGE，例如 CEL(参考资料 Koito， Araki 和 Horiuchi32).在人晶状体蛋白中检测到 CEL 的浓度与 CML 相似，并且其积累随年龄的增长而增加，与 CML 的积累平行(参考资料 Ahmed， Frye 和 Degenhardt36).因此，下调 RAGE 、 CEL 和 CML 表达对于改善糖尿病肾病很重要。在本研究中，寡酚显著降低了 db/db 小鼠肾脏中 RAGE 、 CEL 和 CML 的肾蛋白水平，表明寡醇具有抗氧化活性，对 RAGE-AGE 相互作用引起的糖尿病肾损伤以及功能蛋白与 CML 或 CEL 的复杂复合物具有保护作用。
NF-κB 可被多种外源性和内源性刺激激活，包括高血糖、NEFA、ROS、TNF-α、IL-1β、其他促炎细胞因子、AGE 结合 RAGE 和 p38 丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK）。特别是，AGE 通过与 RAGE 相互作用触发 NF-κB 的激活，导致其易位到细胞核并诱导转录，并且 RAGE 基因的启动子区域包含 NF-κB 结合位点，可能产生自我延续的途径(参考文献 Csiszar 和 Ungvari37).NF-κB 的异常调节与许多慢性疾病有关，包括糖尿病和动脉粥样硬化(参考资料 Ahmed， Frye 和 Degenhardt36).NF-κB 调节大量基因的表达，包括生长因子、促炎细胞因子等(参考资料 Evans， Goldfine 和 Maddux38, 参考资料 Celec39).NF-κB 参与介导炎症过程的 COX-2 和 iNOS 表达的调节(参考资料 Surh， Chun 和 Cha40).NF-κB 激活通过脂质/脂肪酸输注诱导胰岛素抵抗，并通过脂质代谢物（如甘油二酯和神经酰胺）抑制胰岛素信号传导(参考文献 Sinha， Perdomo and Brown41).在我们的 Western blotting 分析中，实验性 2 型糖尿病导致 NF-κBp65 、 COX-2 和 iNOS 蛋白的表达增加，而这三种蛋白的表达在寡酚给药后显著降低。值得注意的是，65 mg/kg 浓度的寡核苷酸完全恢复了 NF-κBp2 、 COX-20 和 iNOS 的蛋白表达，达到 m/m 小鼠的水平。这些结果表明，寡醇的抗炎作用可能与 COX-2 和 iNOS 的下调以及 NF-κB 转录刺激的氧化应激和 AGE-RAGE 相互作用在 2 型糖尿病小鼠肾脏中的抑制有关。
总之，2 型糖尿病状态下的寡醇治疗可改善血脂谱（TAG、总胆固醇和 NEFA）和肾功能。此外，oligonol 可改善脂质代谢异常、氧化应激、AGE 过度形成和炎症等肾脏异常。因此，oligonol 是低分子量多酚的供应商，可以通过改善代谢紊乱（包括血脂异常、氧化应激以及炎症反应）来降低患 2 型糖尿病的风险，部分原因是诱导 AGE。
确认
本研究部分得到了日本文部科学省的助学金 （C）（TY 的第 19500661 号）。J. S. N.、H Y. K.、C. H. P. 和 H. F. 进行了实验工作。T. Y. 设计了实验并撰写了手稿。作者声明不存在利益冲突。
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